第一节 弓形虫与弓形虫病的发现

一、病原体的发现

早在1900年，法国微生物学家Laveran从麻雀体内见到一种疑似今天的弓形虫的虫体。1908年，Nicolle和Manceaux从北非突尼斯巴斯德研究所饲养的一种野生沙漠啮齿动物，类似于仓鼠的刚地梳趾鼠（gundi，学名为Ctenatactylus gundii）的肝脏和脾脏单核细胞内发现一种寄生物。仓鼠在该实验室常被用于利什曼原虫病的研究。由于当时对利什曼原虫（Leishmania sp.）已有了一定的了解，这一新发现的原虫，形态学上类似于利什曼原虫，故当时被称之为“刚地利什曼原虫（Leishmania gondii）”。后来人们通过深入研究发现，该原虫在形态和致病特征与利什曼原虫差异较大，属于一种独立的寄生虫种。因虫体呈半月形或弓形，并且首次分离自刚地梳趾鼠，故命名为刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）。拉丁语中“Toxo-”意为弓形，“-plasma”意为生命或形象。追溯弓形虫的命名过程，由于当时Nicolle和Manceaux误将弓形虫寄生的宿主Ctenatactylus gundii 鉴定为C. gondii，其实本应命名为Toxoplasma gundii，但后来将错就错地称其为Toxoplasma gondii。同年，意大利细菌学家Splendore又在巴西的兔体内发现同样虫体，亦误认为是利什曼原虫，后称其为兔弓形虫（Toxoplasma cuniculi）。有学者曾在鸟类发现一种形态特征类似弓形虫的寄生物，但不同于弓形虫，将其分类为鸟弓形虫属（Atoxoplasma），但后来发现所谓Atoxoplasma是等孢球虫属（Isospora），现称为囊等孢球虫（Cystoisospora）的同物异名（synonym）。从1910年至1939年，各国学者又从家鼠、野鼠和貂等野生动物体内发现弓形虫，而每个学者从一种动物体内分离的弓形虫都命名为一新种。虽然命名不同，但后来都被证实为同物异名。之后，弓形虫作为一种动物疾病的新的病原体而逐渐受到人们的重视。目前认为，刚地弓形虫可寄生于食肉动物、食草动物、食虫动物、啮齿动物、猪、灵长类以及大量其他哺乳动物和鸟类，包括海洋脊椎动物在内的众多温血动物。我国早期文献曾将Toxoplasma译为“弓浆虫”“弓浆体”和“弓形体”。

虽然弓形虫是一种泛宿主的脊椎动物细胞内寄生原虫，但自1908年被认识以后的半个多世纪，一直未发现其有性生殖阶段的终宿主，生活史长期未被阐明。直到1965年，英国格拉斯哥莱德大学的Hutchison发现，弓形虫的感染与接触猫粪有关。作者将弓形虫的包囊喂饲感染了猫弓蛔虫（Toxocara cati）的家猫，采用33%的硫酸锌漂浮法检查猫粪，漂浮物在自来水中保存一年后感染小鼠，结果小鼠出现了弓形虫病。当时人们只知道弓形虫的速殖子和缓殖子两个阶段在水里均不能长久存活，对猫粪便的检查仅发现有猫弓蛔虫卵和囊等孢球虫的卵囊。而Hutchison怀疑，小鼠弓形虫病不可能是由猫弓蛔虫或者囊等孢球虫引起的。他反复进行了感染实验，结果发现仅用含有猫弓蛔虫卵的粪便喂饲的小鼠才出现弓形虫病。据此，他误认为弓形虫是借助猫弓蛔虫这一线虫的卵传播的。Hutchison的上述推测，一度误导了许多学者在此后的4年间进行了弓形虫通过猫弓蛔虫卵传播的研究，其中包括一些弓形虫病研究的著名学者如Dubey，Jacobs，和Frenkel等。1969年，Frenkel发现即使无猫弓蛔虫感染，弓形虫仍可以经猫粪传播，弓形虫感染与猫弓蛔虫无关，从而推翻了所谓的弓形虫籍线虫卵传播的假说。猫粪中弓形虫卵囊的研究进展一度缓慢，其原因在于弓形虫卵囊类似于犬和猫体内的球虫卵囊。1970年之前，球虫卵囊的孢子化孵育采用的是2.5%的重铬酸钾溶液，后者对卵囊的染色质有不利影响，因此卵囊感染小鼠成功率不高。后来改用了2%的硫酸溶液保存和孵育卵囊。由于硫酸易被中和，且用于感染时无须洗涤，显著提高了感染的成功率。有关弓形虫研究历史的大事记见表1-1。

二、终宿主的发现和卵囊形成的机制

Hutchison（1969）将弓形虫的组织包囊喂饲家猫，5天后在小肠上皮细胞内见到裂殖体和配子体，随后在其他喂饲过弓形虫组织包囊的猫粪中发现了大量的弓形虫卵囊（oocyst）；1970年，Frenkel在猫小肠上皮细胞内也发现了有性增殖期虫体；Dubey（1970）对肠上皮内的裂体增殖和配子增殖的形态学和生物学进行了较为详细的观察。与其他球虫不同，猫科动物粪便排出的弓形虫卵囊也可经肠外途径感染小鼠。实际上，1969—1970年间，多个学者几乎同时在猫粪中查见弓形虫卵囊，至此揭开了弓形虫从无性增殖到有性生殖的生活史全过程。后来的流行病学调查结果也表明，猫科动物是目前已知的自然界唯一的终宿主，无猫的地区便无弓形虫经卵囊的传播（Dubey等，1997）。由此可见，猫在弓形虫病的自然传播中起到关键的作用。此后，弓形虫与弓形虫病的研究步入了一个新阶段。

早年，Hutchison和Frenkel等的贡献在于明确了家猫及其他猫科动物在自然条件下是弓形虫在动物之间循环、传播和流行的重要环节，也是人体感染的重要途径之一。随后，弓形虫的生活史借助于家猫可在实验条件下得以完成，而无性增殖阶段的速殖子和包囊均可在细胞培养条件下或者通过小鼠感染获得。当受感染的宿主被另一动物捕食后，前者体内含有缓殖子（bradyzoite）的包囊（cyst）被后者摄入，在新的宿主体内转换为快速增殖的速殖子（tachyzoite），继而扩散到全身器官组织并感染细胞。但是，虫体一旦进入猫科动物的小肠，上述缓殖子-速殖子的无性增殖循环迅速转变：缓殖子发育为裂殖子（merozoite），后者仅感染猫小肠上皮细胞并在细胞内繁殖，进入有性生殖（sexual reproduction）阶段。裂殖子分别发育为雌配子体（female gametocyte或macrogametocyte）和雄配子体（male gametocyte或microgametocyte）。雌、雄配子体发育成熟后成为雌、雄配子，后者受精后发育成卵囊（oocyst），亦称囊合子，并随猫的粪便排出体外，在体外进一步发育成具有感染性的成熟卵囊。长期以来，弓形虫为何仅选择猫科动物作为其有性生殖的宿主（终宿主）？总而言之，弓形虫是通过何种分子感受器去识别宿主小肠的内环境？这种宿主特异性的选择机制始终是个不解之谜。因为现代社会以猫作为家养宠物十分普遍，用家猫作为实验动物用于弓形虫病的研究受到了动物伦理的制约。继2015年美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）停止使用黑猩猩作为实验动物后，美国农业部于2019年关闭了延续数十年的采用家猫作为实验动物用于弓形虫病研究的实验室。

弓形虫生活史发现的半个世纪后，Di Genova等（2019）终于解开了上述的谜团：弓形虫的有性生殖依赖于猫小肠上皮细胞的一种多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），亦即亚油酸（linoleic acid）。作者首先构建了一个猫小肠的模拟器官，感染缓殖子后，注入含有不同营养成分的培养基，其中包括脂类。结果发现，补充亚油酸可显著促进裂殖子分别向雌、雄配子体分化，但加入油酸（oleic acid）则无此现象。与此对应的是，猫的血清中的确含有高水平的亚油酸。然而，在绝大多数哺乳动物体内，delta-6-去饱和酶（delta-6-desaturase）可迅速催化亚油酸转化为花生四烯酸（arachidonic acid），故体内缺少亚油酸的积蓄。但是，由于家猫缺乏delta-6-去饱和酶活性，故体内含有高水平的亚油酸。家猫体内花生四烯酸的水平很低，来源主要依赖于食物（Sinclair等，1979）。受此启发，学者们推测弓形虫对亚油酸分子敏感。当感染弓形虫的小鼠分别给予delta-6-去饱和酶抑制剂和喂饲亚油酸时，结果在小鼠肠上皮细胞内见到了弓形虫的配子（gamete），并在小鼠粪便中查见卵囊。因此“以鼠代猫”在实验室可完成弓形虫生活史的全过程。这一发现虽然尚未阐明弓形虫感知亚油酸浓度的信号通路，但是却摒弃了家猫作为获取卵囊的唯一宿主的动物伦理障碍，同时对于通过强弱毒力的虫株杂交，鉴定弓形虫毒力因子和宿主抗感染的机制研究具有重要意义。此外，这一发现对其他顶复门原虫例如疟原虫和隐孢子虫等的研究也具有重要启迪作用，并为揭示寄生虫-宿主特异性背后的机制研究，提供了新的思路。

三、无性增殖阶段速殖子-缓殖子的期转化

弓形虫感染宿主后在有核细胞内经快速的无性增殖产生大量的虫体，称为速殖子。速殖子侵入宿主后也可引起慢性隐性感染，因为快速增殖的速殖子在宿主免疫因子等应激压力的作用下，可进入相对静止的状态，形成具有逃避宿主免疫攻击和药物杀伤的包囊。Frenkel（1973）在描述弓形虫包囊形成过程时将囊内蛰伏的虫体称为缓殖子。1976年，Dubey等报道，弓形虫感染猫后第11～17天，速殖子转换为缓殖子；反之，缓殖子也可转化为速殖子。这一无性生殖阶段虫体的相互转化过程称为期转换（stage conversion）。已知弓形虫的遗传特征和感染宿主的免疫应答（例如IFN-γ等）诱导的适应性免疫力促进了弓形虫包囊形成。但是，弓形虫调控速殖子向包囊转化的分子机制一直不明。最近，Waldman等利用Cas9介导的筛选和单细胞分析策略，发现弓形虫转录因子BFD1是驱动速殖子向缓殖子转化的关键基因。BDF1通过结合弓形虫的许多期特异性基因启动子，并促进其表达。敲除BDF1后，速殖子无论在体外培养还是在小鼠体内，均失去了成囊的能力。该发现是继卵囊发育必需条件之后，弓形虫研究的又一重要发现。

四、人体弓形虫病的早期研究

早在1908—1920年间，Darling曾先后报告四个临床上疑似弓形虫病的病例，并从患者肌肉、外周血液和脾组织涂片中发现了类似弓形虫的病原体，之后得到证实。因此，Darling的人体弓形虫病与Nicolle和Manceaux在梳趾鼠所见的弓形虫实际上是同年报道的。1916年，Fedorovitch从血片，1920年Chalmer和Komar从脾脏组织涂片中都见到类似弓形虫的滋养体。但是，学界公认的首例具有完整病理报告的人体弓形虫病始于1923年的捷克医生Jankü的观察。该病例为11个月龄的患儿，右眼失明，左眼小眼畸形（microphthalmia），脑积水（hydrocephalus），两侧眼底均有黄斑变性（macular degeneration）病灶，且在视网膜病理切片中查见弓形虫包囊。据此Jankü医生指出弓形虫感染与先天性脑积水有关。1937年，Wolf和Cowen发现一例新生儿脑炎，表现为脑积水和脉络膜视网膜炎（chorioretinitis），尸体解剖在脑组织、脑脊液和视网膜组织查见并分离出弓形虫。由上可知，早期发现的人体弓形虫病多为先天性弓形虫病（congenital toxoplasmosis），临床表现较为典型，例如脑积水或小头畸形（microcephaly）、脑钙化（cerebral calcification）、脉络膜视网膜炎以及意识运动障碍等。1974年，Desmonts等报道了对先天性弓形虫病具有里程碑意义的研究。他们在法国巴黎进行人群弓形虫感染的血清学筛查，分别采集了孕期妇女首次就诊、孕后第7个月和分娩时的血样进行监测。当血清学出现变化后开始采取预防性治疗措施。经过15年的研究证实：①孕期的前6个月感染弓形虫对胎儿的危害最大；②并非所有感染弓形虫的孕妇都会将弓形虫传染给胎儿；③孕前弓形虫血清抗体阳性的妇女，其胎儿不会受感染；④乙酰螺旋霉素治疗可阻止先天性弓形虫的传播，但对已感染弓形虫的婴儿无效。近年有动物实验研究提示，孕前弓形虫血清学阳性的育龄妇女，虽然病原体不会经胎盘垂直感染给胎儿，但是弓形虫感染诱导的母胎界面生理性免疫耐受的失衡，也可能成为不良妊娠结局的因素（Wang等，2018）。

1941年，Sabin等报告一例罹患急性脑炎的5岁患儿，脑脊液中查见弓形虫速殖子。该虫株被分离保种，并取患儿姓名的首字母命名为RH株。弓形虫RH株随后被世界各地实验室引种，八十年来已成为实验室广泛应用的代表性虫株。Sabin等还提出用中和实验和补体结合实验诊断弓形虫病，并采用皮内试验用于流行病学调查。更有意义的是，1948年Sabin-Fedman还创用了弓形虫病独特的免疫学诊断方法，即Sabin-Fedman染色试验（dye test，DT）。该法采用活的弓形虫速殖子与正常血清混合，37℃孵育1小时后，虫体由原来的新月形变为椭圆形或圆形，碱性亚甲蓝染色后由于细胞质对染料具有高度的亲和力而被染成深蓝色，此为阴性。但是，当速殖子与含有抗弓形虫特异性抗体的血清混合，并在含有新鲜补体的血清作为辅助因子（accessory factor）存在时，由于抗原-抗体复合物激活补体，使虫体受到损伤变性，失去对碱性亚甲蓝的着色能力，此为阳性。结果判定按照着色和不着色虫体的比例，以50%的不着色虫体的血清稀释度为终点滴度。一般以1∶8～1∶16为隐性感染；1∶256以上为活动性感染。此法直至20世纪80年代仍有实验室应用。但是，由于该法需要筛选含有补体的新鲜人血清，实验需要活的弓形虫而存在生物安全隐患，且操作烦琐，结果判定具有主观性等弊端，后逐渐被新技术所取代。

获得性弓形虫病的报道始于20世纪50年代。Pinkeston和Weiman于1940年和1941年先后报告两例获得性弓形虫病的死亡病例。Siim等（1956）认为淋巴结病是获得性弓形虫病的常见症状，后被Beverley（1958）通过30例获得性弓形虫感染病例观察后得以证实。1979年、1997年和2006年在美国、加拿大和巴西分别暴发了急性弓形虫病（De等，2006），获得性弓形虫病的临床症状得以全面认识。在美国，弓形虫病是前三种需要住院治疗的食源性感染病之一。

五、我国弓形虫病的发现和研究概况

我国弓形虫与弓形虫病的发现和研究历史大体可分为三个阶段。

（一）病原发现阶段

1955年以前，我国对于弓形虫与弓形虫病无明确认知。1955年7月，于恩庶等在福建平潭进行恙虫病调查时，采用小鼠接种首次从家兔和猫体内分离出4株弓形虫；接着又从猪、豚鼠和黄毛鼠等动物中分离到弓形虫，经过反复鉴定得到确认（于恩庶等，2000）。于恩庶是我国弓形虫与弓形虫病的开拓者和奠基人。1955—1965年的10年间，于恩庶等主要对上述分离的虫株进行生物学特性观察，调查了动物宿主，并借鉴国际上通用的补体结合实验、中和实验和染色实验，开展免疫学诊断研究。同时改进病原体分离方法，应用猴肾和乳猪肾单层细胞体外培养弓形虫等。从1955年弓形虫在我国的发现到此后的20年间，除了福建于恩庶实验室以外，鲜有学者对该虫进行研究。在此期间，对弓形虫的生物学特征、传播途径、易感动物、家畜家禽的感染，尤其是对人体健康的危害等知之甚少。但值得一提的是，此间发现家猫和家猪感染弓形虫，也发现了两例人体弓形虫病：其中一例是谢天华（1964）在江西报道的弓形虫眼病；另一例则为福建省长乐县的患者，其血清染色实验和补体结合实验均呈强阳性，并伴有神经系统表现，经磺胺嘧啶和乙胺嘧啶联合治疗后好转出院，但后因复发而死亡。从福建分离的虫株先后被引种至北京和广州等地。在此期间，于恩庶在福建采用上述免疫学技术对人群弓形虫感染进行了调查，对象包括农民、学龄前儿童和小学生，阳性率为1.4%～8.1%。此间，临床上弓形虫病仍被认为是一种罕见病。

（二）家畜和人体弓形虫病的研究阶段

20世纪60年代末，我国许多省市发生大批猪群的“无名高热”，病因一直不明，抗生素治疗无效。1977年夏，上海畜牧兽医研究所的吴硕显和上海乳肉管理所对上海长宁区养猪场暴发的“无名高热”病猪进行研究。该养猪场猪的发病率几近100%，死亡率达64%。将病料接种于小鼠，从腹腔渗出液中查见了弓形虫速殖子。同年9月，江苏省农科院畜牧兽医研究所的计浩等也从丹阳、南京和汤山等地“无名高热”病猪的病料组织中分离出弓形虫。以上发现证实，猪的所谓“无名高热”实为弓形虫病。此后对江苏省47个县（市）的商品猪、家猫和人群采用间接血凝（indirect hemagglutination，IHA）试验检测，结果发现商品猪的抗体阳性率高达37.14%；家猫阳性率为73.00%；而人群的抗体阳性率为4.58%。

计浩（1979）还见到弓形虫在宿主细胞核内寄生并增殖的现象，并对侵入增殖进行了动态观察。此外，北京、辽宁、湖北、山东和浙江等地也相继报告了猪弓形虫病的流行。猪弓形虫病的暴发流行，是20世纪70年代后期我国畜牧兽医领域的一项重要发现，由此也引起医学和兽医学对弓形虫与弓形虫病研究的热潮。在此期间，我国各地，尤其是畜牧兽医研究单位建立了各种血清学诊断方法。除了IHA外，尚有免疫酶技术、对流免疫电泳、放射免疫技术等。沈继龙等（1982）首先采用滤纸血片洗脱法，现场采集猪血制成滤纸干血片，将葡萄球菌蛋白A连接的酶联免疫吸附试验（Staphylococcus protein A ELISA，SPA-ELISA）用于山东家猪的弓形虫感染调查，并对虫体抗原的纯化进行了改进，使抗原用于SPA-ELISA的免疫诊断获得良好效果。邹宝生等（1982）用胰酶消化感染小鼠的腹腔液，结合离心法提取虫体，纯度达99%以上。沈继龙（1983）采用胰酶水浴消化小鼠腹腔液，经G3玻璃砂芯漏斗抽滤，也获得了97.7%高纯度的虫体，纯化后的虫体不失其对小鼠的致病性。但是后来用电镜观察到，胰蛋白酶对速殖子表膜成分有一定损伤作用。

我国首次规模化人群弓形虫感染的血清学调查始于1985—1988年。当时由广西卫生防疫站崔君兆组织牵头的“中国人畜弓形虫病调查协作组”，对19个省份141个县的81 968人，采用IHA对血清样本进行了检测，弓形虫抗体阳性率从0.33%到11.8%不等，平均为5.17%；检查37种动物血清39 107份，阳性率为13.28%。其中以家猫和猪的阳性率最高，是我国弓形虫感染的主要传染源。该次调查还从人畜分离出若干虫株，发现11个病例。此次调查，获得了弓形虫在我国人畜间感染的基础数据，为我国人畜弓形虫病的防治提供了重要参考。

1983年以后，我国各地进行了许多人畜血清学调查。由于当时技术条件的限制，各地采用技术方法和操作程序不统一，特异性和敏感性也有差异，故可能存在假阳性和假阴性现象。人群（包括孕妇）阳性率地区间差别较大，从0.98%（福建）到14.39%（宁夏）不等。某些特殊人群例如屠宰场工人、高龄人群、宠物猫饲养者等阳性率高于其他人群，性别间无明显差异。IHA或者ELISA检测动物血清阳性率以猪为例，从8.10%（新疆）到61.40%（上海）不等。2001—2004年，我国在15个省份进行了第二次较大规模的人体寄生虫感染调查，采用了ELISA等血清学方法对弓形虫等组织内寄生虫感染进行调查。结果发现，在47 444人中，西部人群阳性率为10.93%（其中苗族高达25.44%），中部为6.28%，东部为7.53%，平均阳性率为7.88%（标准化阳性率为7.91%）。同样，阳性率在性别之间无差异，但各年龄组之间有显著差异，随年龄的增长而升高；动物饲养员等特殊职业人群抗体阳性率高于普通人群。由于本次调查与1983年的调查（阳性率5.17%）技术和抽样方法不一，有学者认为弓形虫血清学阳性率有上升趋势（许隆祺等，2000）。但是必须考虑到，由于早年血清学调查大多采用IHA，与近年采用的ELISA相比敏感性低，因此我国人群弓形虫感染率是否逐年升高，尚待采用统一的方法持续跟踪调查。Dong等（2018）总结了我国食源性家养动物（绵羊、山羊、猪、鸡、牛）和人群感染调查数据，发现前者感染率为23.7%，后者为8.2%，长江流域和黄河中下游动物血清抗体阳性率高于其他地域。

由上可见，20世纪80～90年代，虽然我国由于各地自然条件、民族习俗、调查时间、技术方法、实验操作等存在差异，但总体来看，由于当时作为肉食品的动物大多为散养，以猪为代表的家畜弓形虫感染率较高，对人体感染也构成潜在的威胁。总体来看，虽然我国动物（尤其是家养动物）弓形虫感染率较高，但是与欧洲、拉美和非洲等相比，我国人群平均弓形虫血清学阳性率仍属于较低水平。例如，美国疾病预防控制中心（CDC）根据1999—2004年连续5年的调查结果，估计普通人群感染率为10.8%，15～44岁育龄期妇女感染率为11.0%（Jones等，2007）；巴西成人弓形虫抗体阳性率高达50.0%～80.0%，且时有经口感染的暴发流行；非洲住院患者血清阳性率高达68.0%（Faustina等，2017）；欧洲个别国家虽然在器官移植患者的弓形虫抗体阳性率较低，但是弓形虫病至今仍然是欧洲的重要疾病负担；处于亚欧交界的土耳其，也有三分之一的人群感染弓形虫。自1964年谢天华报告我国首例人体弓形虫病以后，至1999年见诸文献的人体弓形虫病有500多例，其中先天性弓形虫病242例，获得性弓形虫病267例，分布于20多个省份。在此期间，我国医学与动物医学实验室所用的虫株除了RH株以外，还有CN株（长宁、上海）、KS株（昆山、江苏），NT株（南通、江苏）、ZS株（中山、广东）等，分别采自动物或患者体内。

在此时期，除了开展规模不等的人畜弓形虫病血清学调查外，各实验室对弓形虫的形态学（主要为速殖子）、毒力、宿主易感性、抗原分析与纯化、免疫学以及核酸检测技术的构建、抗感染免疫、病理变化、疫苗研究、药物治疗等开展了诸多研究。20世纪90年代，于恩庶等曾数次主持召开中国微生物学会人兽共患病病原学分会的全国“三体”（立克次体、螺旋体和弓形体）学术会议。由于Toxoplasma gondii属于寄生原虫，后统一将“弓形体”的译名改为弓形虫，以区别其他医学微生物。由于弓形虫可引起人体严重的疾病，因此各国学者开展了大量的研究。20世纪80年代中期，随着艾滋病的发现和此后发病率的增高，弓形虫因可导致免疫抑制患者的严重并发症而受到广泛关注。因此，有学者把弓形虫视为再现的传染病（re-emerging infectious disease）。进入21世纪后，由于抗HIV感染者/AIDS患者的药物治疗获得突破性进展，患者并发的临床弓形虫病报告有明显下降。与欧美国家相比，我国人群弓形虫感染率较低，因此我国HIV感染者/AIDS患者免疫抑制并发的弓形虫病已属罕见。鉴于我国人畜弓形虫感染的实际情况，为了预防产前感染致不良妊娠结局和优生优育，国家有关部门已将TORCH检测推荐为妊娠12～14周的产前病原感染检查项目和孕前优生健康的检查项目。TORCH包括弓形虫（Toxoplasma gondii）、风疹病毒（Rubella virus）、巨细胞病毒（Cytomegalovirus）、疱疹病毒（Herpes simplex）以及其他感染因子，例如HIV和梅毒螺旋体等，均可经胎盘垂直感染至胎儿。

（三）病原与临床等综合研究阶段

总体上看，我国弓形虫与弓形虫病的研究在20世纪多集中在病原体、人畜感染、诊断技术以及抗感染免疫、发病机制与病理、临床诊断与治疗和疫苗的初步研究。近20年来，随着高学历以及具有海外深造背景的年轻人才的加入，我国弓形虫和弓形虫病的研究得到飞速发展，内容逐步深入到基础性和前沿性研究。秉持人类卫生健康共同体以及同一健康（One Health）的理念，医学和动物医学研究的学科交叉和深度融合，多维度推进了弓形虫病的研究。此外，自我国历史上严重危害人民健康和社会经济发展的寄生虫病例如丝虫病、疟疾、黑热病和血吸虫病等被相继消除和有效控制后，作为食源性寄生虫病之一的弓形虫病的研究热度不减，且渐趋活跃。在国家自然科学基金立项资助的项目中，弓形虫与弓形虫病在医学寄生虫学与动物寄生虫学领域所占比例不断升高。据新近统计，《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》自1983年创刊以来发表的高被引论文和研究内容中，弓形虫病仅次于血吸虫病、疟疾和棘球蚴病之后，位列第四。统计PubMed收录的中国弓形虫与弓形虫病研究SCI期刊文献数，从2016年到2020年逐年增加。以上说明我国在弓形虫与弓形虫病研究领域的深度、广度和创新性在不断提升，主要进展包括以下几个方面：

1.弓形虫基因型研究

全球各地动物宿主包括人体分离的弓形虫均属于同一物种，即刚地弓形虫。自20世纪后期以来，人们对从各地分离的虫株进行遗传结构的分析结果发现，弓形虫具有丰富的遗传多态性，亦即不同地域或宿主种群的分离株具有相对特征性的基因结构。到目前为止，ToxoDB已经收录了近300个弓形虫基因型。流行欧洲、北美和非洲的弓形虫大多属于Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等3个克隆谱系（clonal lineage）；南美洲的人兽分离株具有更加丰富的遗传多态性，已报道百余个基因型。早期由于我国学者缺乏对弓形虫虫株的广泛分离、收集和保存，对该领域贡献微弱。然而，21世纪开始，随着我国经济的飞速发展和国家对科技投入的显著增加，近年我国学者对从人体及动物获得的弓形虫虫株或弓形虫DNA进行多位点的基因分型，结果发现了12个基因型。有意义的是，从我国分离的弓形虫虫株的基因型与世界其他地区相比具有显著的差异。在已鉴定的虫株中，ToxoDB#9（即Chinese 1型）在人体和家养动物分离株中占74.0%，在野生动物中占48.5%（Pan等，2017），为我国大陆的优势基因型，并被命名为Chinese 1型（Chen等，2011），其次为Ⅰ型。此外，Chinese 1基因型含有强毒和弱毒两个类群，后者在小鼠脑内可形成包囊。免疫功能受损患者的弓形虫病，多为成囊型的弓形虫引起的。有趣的是，我国优势基因型虫株的若干重要效应分子也具有显著特征：棒状体蛋白ROP16与Ⅰ型或Ⅲ型虫株相同（ROP16_Ⅰ/Ⅲ）；致密颗粒蛋白GRA15则与Ⅱ型虫株相同（GRA15_Ⅱ）（Cheng等，2017）。在感染早期的固有免疫阶段，ROP16_Ⅰ/Ⅲ诱导M2巨噬细胞的极化；而GRA15_Ⅱ驱动M1巨噬细胞的极化。这种基因型相关的效应分子的多态性直接影响感染的结局，至少在小鼠模型中具有这种现象。我国人兽间流行的Chinese 1型弓形虫虫株携带的特征性效应分子，提示其具有差异的毒力和特征性的致病机制。Chinese 1基因型弓形虫是否如南美洲那样是上述欧美地区三个克隆系虫株的杂交后代，抑或是在我国独立演化的谱系，尚不明确。我国的这一优势基因型弓形虫是否存在其他独特的效应分子和宿主免疫调控分子等诸多科学问题，尚待进行深入研究。

2.弓形虫效应分子及其功能研究

弓形虫在与宿主漫长的共进化过程中，演化出若干可调控、干扰或改造其寄生环境的非凡能力。其中重要的策略是在入侵宿主细胞的过程中分泌大量的效应分子（effector）。这些功能性效应分子主要储存在虫体的微线体、棒状体、致密颗粒等细胞器中，释放后分布于虫体表面、宿主细胞内部、纳虫泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）及纳虫泡内等，在虫体识别（recognition）、入侵（invasion）、免疫逃逸（evasion）、复制（duplication）和逸出（egress）等特定的时相中，参与虫体-宿主细胞的相互作用，与弓形虫的毒力、免疫逃逸和致病密切相关。弓形虫效应分子的功能及其与宿主细胞之间的互作是近年国内外研究的热点。一般认为，与弓形虫毒力相关的分子，ROPs蛋白家族参与虫体的入侵。然而，Wang等（2017）采用CRISPR/Cas9分别敲除了15个RH株的ROPs基因，结果发现无论对虫体在HFF细胞内的增殖，还是其对小鼠的急性致病力均未见明显影响。Wang等（2018）敲除Chinese 1型强毒Wh3株的ROP16，也获得同样结果。以上提示ROP16_Ⅰ对虫株的急性毒力影响不大。通过蛋白质组学筛选研究发现，弓形虫丝氨酸/苏氨酸激酶ROP18可结合、并磷酸化神经元的内质网高表达的蛋白RTN1-C，从而触发内质网应激（ER stress）并介导神经元凋亡；RTN1-C的磷酸化还可以抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC），上调葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达，进而加重神经元的凋亡。上述的ROP18-pRTN1-C-HDAC信号通路可能与艾滋病患者的弓形虫脑炎的致病有关（An等，2018）。ROP18已被证实是弓形虫重要的毒力因子之一。Xia等（2018）采用双分子荧光互补技术（BiFC）对Ⅰ型和Ⅱ型虫株的ROP18互作的宿主靶蛋白进行了高通量筛选。结果显示，ROP18_Ⅰ与ROP18_Ⅱ分别有492个和141个结合蛋白，均与宿主的免疫应答、细胞凋亡和虫体逃逸有关。

Wang等（2018）采用CRIPSR/Cas9敲除分离于我国的弓形虫强毒虫株Wh3的ROP16_Ⅰ基因，然后感染怀孕小鼠。结果显示，与野生型相比，ROP16_Ⅰ基因敲除虫株的毒力并未减弱，且可引起滋养细胞凋亡加重，rop16-/-虫株感染小鼠表现为胎鼠被吸收、胎盘出血和流产；胎盘和脾脏淋巴细胞IL-12、IL-17和IFN-γ表达上调，而Treg细胞数减少，IL-4、IL10和TGF-β1等细胞因子表达水平显著下降。上述结果提示，中国Chinese 1基因型虫株在ROP16敲除后，具有GRA15_Ⅱ遗传背景的虫株感染小鼠的特性，可破坏孕期母-胎界面的生理性免疫耐受。此结果也提示，弓形虫感染除了直接侵犯胎盘或胎儿外，母体的免疫应答仍有导致流产等不良妊娠结局的可能。

血吸虫病肝纤维化的基本机制是M2-Th2型免疫应答诱导了肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）活化。基于弓形虫的GRA15_Ⅱ能够诱导巨噬细胞向M1极化。Xie等（2018）采用弓形虫GRA15_Ⅱ基因转染的巨噬细胞输入到患有日本血吸虫病的小鼠体内，试图用于肝脏纤维化的治疗。结果发现，表达GRA15_Ⅱ的巨噬细胞与肝星状细胞共培养，可显著抑制后者的增殖和胶原合成；感染血吸虫的小鼠输注该巨噬细胞后，显著减轻肝脏胶原沉积，肉芽肿反应减轻，参与胶原合成的TGF-β、α-sma和Arg-1表达下调；而促进纤维蛋白降解的MMP-13则表达上调。基于不断积累的研究结果，可以认为采用弓形虫等寄生虫来源的外泌体或效应分子（包括miRNAs、circRNAs、lncRNAs等）研究感染与某些免疫相关性疾病，甚至肿瘤的免疫治疗等，具有潜在的理论和实际应用价值。

3.抗感染免疫与致病机制

弓形虫感染宿主组织器官可导致其发生显著的改变。在组学研究中，采用RNA-Seq和iTRAQ分析弓形虫感染的猫和小鼠肝脏以及猪外周血单核细胞转录组与蛋白质组学，结果发现数百种基因转录和蛋白质表达丰度均出现显著变化，部分蛋白质与宿主细胞代谢有关，但是差异表达的蛋白质在疾病发展中的生物学意义尚待研究。He等（2017）观察到弓形虫感染宿主细胞有892个蛋白磷酸化；在感染早期（2～6小时）宿主细胞的主要变化是细胞周期的调节和细胞骨架的重排。

弓形虫感染诱导的宿主免疫应答是一种被广泛应用的抗感染免疫研究的模型。虽然感染可以诱导宿主IgM、IgG和IgA等抗体的分泌，但是就保护性免疫而言，M1-Th1应答在固有免疫和适应性免疫应答中发挥关键作用。弓形虫入侵宿主细胞时，其棒状体颈部首先分泌多种蛋白质（称为rhoptry neck complex，RONs）进入宿主细胞，通过与细胞形成紧密的移动连接（moving junction，MJ）而进入宿主细胞内。在此过程中RON2，RON4，RON5和RON8以及AMA1等分泌蛋白发挥重要作用。宿主细胞被弓形虫入侵后，细胞膜内翻包裹虫体，形成纳虫泡以避开宿主溶酶体的破坏，以利其分裂增殖。已知弓形虫分泌的效应分子可引起宿主能量代谢、免疫应答和信号传导等相关基因的转录。虫源性分子首先结合模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）。弓形虫抑制蛋白（profilin）结合小鼠的TLR11和TLR12以及人类的TLR2、4、8和9，可触发强烈的IL-12应答，激活免疫相关的GTP酶（IRGase）并诱导IFN-γ的产生。急性感染阶段的宿主免疫应答与弓形虫基因型相关。如前所述，Ⅱ型以及Chinese 1型虫株的GRA15_Ⅱ以及其他基因型相关的效应分子（genotype-associated effectors）可诱导M1巨噬细胞的极化，诱导其高表达IL-12、TNF-α、IL-1β和iNOS等，产生NO并启动适应性免疫应答，激活Th1、NK和细胞毒性T细胞等，进而诱导IFN-γ的大量生成，并在小鼠的宿主细胞内发挥杀虫作用。弓形虫感染的小鼠，其IL-12可经自然杀伤细胞TLR-MyD88信号通路促进IFN-γ的分泌（Ge等，2014），是宿主固有免疫的重要机制。已知宿主INF-γ的水平是促进弓形虫包囊形成的关键因素之一。免疫缺陷患者低水平的INF-γ可直接诱发隐性弓形虫包囊的活化，引起严重甚至致死性的弓形虫病。

值得注意的是，人体的抗弓形虫免疫应答机制与小鼠具有显著差异。人体缺乏小鼠的某些功能性的TLRs和IRGs，而小鼠的IFN-γ和iNOS是抗虫免疫的关键细胞因子，但在人体细胞内并非如此。最近我们将弓形虫PRU野生虫株和GRA15_Ⅱ基因敲除虫株感染的人单核细胞（THP-1）与肝细胞共培养，前者高表达NLRP3炎性小体依赖的IL-1β；在IFN-γ协同下肝细胞高表达iNOS。但与此同时，肝细胞内吲哚胺2，3-双加氧酶1（indole amine 2，3-dioxygenase 1，IDO1）的表达显著下降，而IDO1恰是IFN-γ诱导的人类宿主细胞杀伤虫体的关键效应分子。因此，GRA15_Ⅱ诱导的iNOS的高表达，反而促进了虫体在人肝细胞内的增殖（Bando等，2018）。

弓形虫的致病与虫株的基因型、毒力、宿主种类及其免疫状态等因素密切相关。欧美国家人体弓形虫病多是Ⅱ型虫株引起的，而我国人体分离株或DNA分型发现以Chinese 1型居多，部分为Ⅰ型和Ⅲ型等虫株。国内对弓形虫引起的不良妊娠结局的研究较深入。已知母-胎界面蜕膜细胞和调节性T细胞（Tregs）是维持母体孕期生理性免疫耐受，维持胎儿宫内发育的必要条件。蜕膜细胞蛋白质组学分析显示，在弓形虫感染的181个差异表达蛋白中，有11个与滋养细胞浸润、胎盘发育、宫内胎儿生长以及免疫耐受有关（Zhang等，2018）。胎盘蜕膜PD-1+ Tregs的数量减少和功能损伤，Ⅱ型虫株（PRU）感染诱导的蜕膜巨噬细胞向M1极化均与不良妊娠结局的发生密切相关（Zhang等，2019；Liu等，2018）。TGF-β可抑制弓形虫感染导致的蜕膜NKs（dNKs）细胞的杀伤毒性，表现为dNKs的NKD2D/DAP10、穿孔素、颗粒酶和IFN-γ的表达下调，dNKs杀伤亚群数量减少（Xu等，2017）。此外，有研究结果显示，用弓形虫分泌排泄抗原（ESAs）处理孕期小鼠，可导致Tregs细胞数量的减少和功能的损伤（Chen等，2013）。敲除ROP16的Chinese 1型弓形虫Wh3株可诱导孕鼠全身和母-胎界面的M1-Th1优势应答，产生IL-17和IFN-γ等诸多炎性因子，IL-10和TGF-β水平降低，结果干扰了孕期生理性免疫耐受，导致不良妊娠（Wang等，2018）。有趣的是，小鼠在孕中-晚期常伴有黄体酮和雌二醇水平升高，弓形虫Ⅱ型（PRU）和Ⅲ型（VEG）虫株可利用自身的羟基类固醇脱氢酶（Tg-HSD）将宿主的性激素转输至虫体内，促进弓形虫的增殖，间接参与弓形虫的致病（Zhang等，2018）。

一般认为，免疫功能正常者感染弓形虫后常无明显的临床表现，或仅有一些轻微的症状和体征。近年日益增多的资料提示，成人获得性弓形虫感染与神经精神障碍及行为异常有关（Torrey等，2007）。隐性感染状态的小鼠出现对捕食者的恐惧，脑皮质内包囊可诱导小胶质细胞活化，免疫相关基因转录分泌炎性因子（IFN-γ、IL-12/IL-23 p40等），引起神经元的损伤，宿主探索行为增强（Boillat等，2020）。包囊可诱导小鼠脑内某些特征性miRNAs和circRNAs的表达（Zhou等，2020）。小鼠感染弓形虫后2个月出现神经行为异常；组织病理学检查显示星状胶质细胞和小胶质细胞活化、神经元凋亡、突触减少；神经组织高表达炎性因子和趋化因子，同时伴有神经递质减少；NF-κB和多巴胺信号通路被激活等一系列病理改变（Wang等，2019）。

4.实验诊断技术与疫苗研究

（1）实验诊断：

弓形虫病的实验诊断包括病原学诊断、免疫学诊断和核酸诊断。从1954年到1976年的20余年时间里，我国的实验室（主要为兽医学）以病原学诊断技术及其应用研究为主，例如动物排泄分泌物或组织印片的直接涂片、吉氏或瑞氏染色、免疫荧光染色，以及病理组织切片染色后速殖子的辨识。早年人们用病料接种低龄小鼠是一种常用的病原诊断和虫体分离的手段。例如徐秉锟等（1979）用患者淋巴结组织接种小鼠，获得了两株弓形虫（ZS1和ZS2）。于恩庶等（1954）、杨惠珍等（1991）、傅翠娥等（1992）对小鼠接种病料用于病原学诊断进行了评价。事实上，利用小鼠接种动物或人的病料分离弓形虫至今仍是最有效的方法之一。组织培养则是病原诊断的另一可选择的技术，以减少对动物的使用。弓形虫对宿主细胞无明显的选择性，因此用于感染弓形虫的培养细胞种类较多。早年于恩庶采用了猴肾或猪肾单层细胞作为宿主细胞；后有人相继采用仓鼠、沙鼠、家兔、鸡胚或人源的原代细胞或细胞系检测弓形虫。病原学诊断阳性结果虽是金标准，但是动物接种或组织培养敏感性低，操作烦琐，需时较长，且有动物伦理的制约和实验室生物安全的风险，故不作常规诊断使用。

从1977年到1985年前后，随着全国兴起的家畜和人体弓形虫感染的调查，各种免疫学诊断技术应运而生。虫体纯化方法逐步优化，包括胰酶消化法（沈继龙等，1983，1991；俞乃勋等，1983；杨惠珍等，1984）、纤维滤膜过滤法（刘佩梅等，1996）、玻璃纤维过滤法（毛克强等，1985）、植物血凝素亲和分离法（沈继龙等，1991）和梯度离心法（陈观今等，1993）等。诊断抗原包括全虫抗原、细胞质抗原、膜抗原、分泌排泄抗原等。膜抗原据称具有早期诊断的价值，采用SDS-PAGE和Western blotting等分析发现，P30-P35抗原（类似SAG1）具有很高的特异性和敏感性（陈彩华等，1993）；夏爱娣等（1996）建立了弓形虫cDNA文库，为诊断抗原的表达提供了捷径；傅翠娥等（1989）在国内首次获得了三株弓形虫单克隆抗体用于循环抗原的检测。此间使用的免疫学诊断技术包括染色实验（DT，于恩庶等，1965；杨树森等，1981；崔君兆等，1983）、凝集试验（AT）、酶联免疫吸附实验（ELISA，沈继龙等，1983；牛安欧等，1994）、间接荧光抗体试验（IFA，黄桂森，于恩庶等，1986）、放射免疫诊断（马义武等，1981，1986）等。1982年中国农科院兰州兽医研究所研制了间接血凝试验（IHA）试剂盒并商品化出售，为此后的血清学调查和个例诊断提供了统一的质量均一的诊断试剂。傅翠娥等（1989，1995）采用单克隆抗体双夹心法检测弓形虫循环抗原，为急性或现症感染的诊断提供了可能，后来逐渐被PCR及其衍生的技术所取代。2015年，由浙江省医学科学院寄生虫病研究所等三家单位联合起草了《弓形虫病的诊断》行业标准，并于次年发布实施。目前弓形虫病诊断的ELISA商品化试剂已成为常用的抗体检测工具。改良凝集试验（modified agglutination test，MAT）也因其简便快速，结果可靠已被广泛采用。无论采用何种免疫学技术，诊断抗原或者单抗的特异性和敏感性决定了技术的可靠性。近年采用弓形虫多表位融合抗原构建的凝集技术、层析技术和ELISA，显示出良好的应用前景。

自Burg（1988）以弓形虫B1基因作为靶基因用于感染的诊断以来，PCR及其衍生技术用于弓形虫病的诊断已被各地普遍使用。夏爱娣等（1992）、陈晓光等（1993，1996）和甘绍伯等（1999）先后采用PCR或巢式PCR扩增B1等基因，均获得较满意效果。PCR以及基于DNA恒温扩增的LAMP技术检测B1、SAG1基因或529bp片段渐成为继病原学检查之后的可靠的诊断技术（Pan等，2017）。

由于弓形虫感染宿主多呈慢性隐性病程，缺乏典型的症状或体征，因此可靠的辅助诊断技术尤为重要。采用标准化的血清学和核酸检测技术，对我国人群（尤其是孕妇和肿瘤患者）以及家养动物进行规模化的弓形虫感染的调查，对我国弓形虫病潜在危害的评估和防治具有重要意义。

（2）疫苗研究：

我国的抗弓形虫感染疫苗的研究起步较晚。早在20世纪90年代，受到Buxton等（1995）用活虫疫苗接种绵羊获得成功的鼓励，我国学者尝试了灭活或减毒速殖子疫苗，但均未获满意结果。以细胞因子为佐剂，观察弓形虫若干效应分子（ROPs、GRAs和MICs）以及表膜抗原（SAGs）的天然或重组蛋白质疫苗和DNA疫苗效果，免疫动物均出现了M1-Th1型免疫应答，并在一定程度上可抵御强毒株弓形虫的攻击感染，但是免疫保护的持续时间和强度远达不到候选疫苗的目标。可能的原因之一是动物模型为易感动物小鼠，且攻击感染所用的虫株多为强毒株（例如RH株）。然而，除了南美洲外，人体感染多为成囊株，疫苗诱导的免疫力不足以抵御易感动物的急性感染。秉持医学和动物医学的同一健康（One Health）理念，弓形虫疫苗的研发理论上是可行的。理由是：①弓形虫的生活史、宿主种类以及传播途径业已明确；②虽然全球各地以及从各种宿主分离的虫株具有丰富的遗传多态性，但是弓形虫只有一个种，疫苗接种的效果差异不大；③基于家畜、终宿主家猫以及人用疫苗可采用不同的策略，例如在牛、猪和鸡用疫苗，主要阻断或减少包囊负荷，在绵羊疫苗主要是预防经胎盘的感染，而家猫疫苗旨在阻断或减少卵囊的排出，降低环境污染风险；④随着肉类食品感染风险下降和环境中卵囊减少，人体感染几率会大幅下降；⑤虽然小鼠抗弓形虫免疫的机制与家畜和人体有很大差异，但是对弓形虫感染诱导的宿主免疫已经有了广泛的认识；⑥目前已有成功的商品化减毒活疫苗用于绵羊的预防。从目前对弓形虫候选疫苗的研究结果看，活虫被宿主细胞吞噬后，可不断分泌抗原成分，维持M1-Th1优势免疫应答和高水平的抗体应答，因此活虫疫苗效果远优于死虫或分子疫苗（Innes等，2019）。

虽然基于分子抗原的疫苗研究尚未筛选出具有实用价值的疫苗，但是随着CRISPR/Cas9等基因编辑技术的普及、尿嘧啶营养缺陷型（uracil auxotrophs）虫株构建成功，以及弓形虫成囊关键分子的鉴定，基于活虫的疫苗研究仍有成功的希望。