第二节　肝癌微环境中间质细胞及免疫细胞

肝癌微环境中主要包括细胞成分和非细胞成分,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)、肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)、内皮细胞、各种免疫细胞联同肿瘤细胞一起,共同构成了肝癌微环境中的细胞成分。 这些细胞通过细胞间相互作用、细胞基质相互作用在肝癌发生发展中起到重要作用。 本节将重点介绍肝癌微环境中的间质细胞和免疫细胞,详述这些细胞在肝癌发生发展中的作用。

一、肝癌微环境中的间质细胞

(一)肝星状细胞(HSCs)

HSCs 曾先后被称为贮脂细胞(fat-storing cells)、Ito 细胞(Ito cells)、脂细胞(lipocytes)、间质细胞(interstitial cells)或窦周细胞(peri-sinusoidal cells)等,占肝脏细胞总量的5%～10%。 HSCs 具有静息和激活两种状态,主要分布于Disse 间隙,包绕于肝血窦外。 生理状态下HSCs 处于静息状态,当肝脏受到物理、化学和微生物感染等病理因素刺激时,HSCs 活化增生,在多种细胞因子和活性氧自由基的作用下,分泌大量细胞外基质,最终通过表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)导致肝脏纤维化的发生。 HSCs 活化可受TGF-β、PDGF、Hedgehog、Notch等多种信号通路调控。

近年来研究表明,HSCs 除了在肝纤维化中发挥重要作用外,还能通过多种机制参与肝癌的发生发展,在肝癌的演变过程中扮演重要角色。 Amann 等研究发现,来源于HSCs 的培养上清可促进肝癌细胞的生长。 此外,在3D 培养条件下,HSCs 的培养上清可通过ERK 和NF-κB 信号通路抑制肿瘤中心区域的坏死。 更为深入的研究显示,HSCs 可以通过分泌细胞因子(如肝细胞生长因子、白介素-6)等改变肝癌细胞表型,从而影响肝癌细胞的增殖和侵袭能力。 近年来研究表明,肝癌细胞与HSCs 存在双向的串联对话影响,不仅仅HSCs 可以影响肝癌细胞,肝癌细胞的代谢及分泌组学改变也能激活HSCs,HSCs 激活后可促进VEGF-A 和MMP9 的表达,从而形成一个促进血管新生的肿瘤微环境。 这些分泌蛋白的高表达往往意味着患者较差的预后和较高的转移风险。 HSCs 还可以分泌诱导肝癌细胞发生上皮间质化、调节细胞外基质合成与降解、参与肿瘤免疫抑制的细胞因子(如TGF-β、细胞外基质相关蛋白、MMP 家族蛋白等)。 此外,HSCs 的旁分泌作用也被广泛报道,在肝癌微环境的多种因素作用下,HSCs 被激活进而分泌VEGF-A,作用于微环境中的内皮细胞,加速肿瘤组织内的血管新生。

(二)肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)

CAFs 是多种肿瘤(尤其是乳腺癌和胰腺癌)间质中最常见的一种细胞,它在肿瘤与基质的相互作用中发挥重要作用。 CAFs 由TGF-β 激活,促进多种细胞外基质成分的合成,沉淀及重构,例如一系列的胶原蛋白的合成。 CAFs 可参与调节肝细胞癌的生物学活性。 Mazzocca 及相关研究人员发现肝癌细胞的生长、血管侵袭及播散转移均依赖CAFs 的存在,并且肝癌细胞可反向刺激CAFs 的增殖,该发现提示了CAFs 在肿瘤-基质交互作用中发挥重要作用。 CAFs 可分泌多种不同的生长因子,包括肝细胞生长因子(HGF)、上皮生长因子(EGF)家族的各个成员、成纤维细胞生长因子(FGF)和Wnt 家族成员,此外还表达多种细胞因子,如基质衍生因子SDF-1α 和白介素-6。 这些细胞因子对于肝癌的发生发展具有重要作用。

(三)内皮细胞

肝癌组织和正常组织中的内皮细胞具有不同的分子表达及细胞功能。 肿瘤相关内皮细胞较正常组织内皮细胞具有快速的细胞转化能力、较强的运动迁移能力以及高表达的CD105 和TGF-β1 的特点。更为引人注目的是,对于表达CD105 的内皮细胞而言,TGF-β1 对其能起到明显诱导作用,从而促进肿瘤血管新生。 近期研究表明,从肝癌中分离的CD105 阳性内皮细胞血管生成活性明显增强,同时这类细胞对化疗药物及血管生成抑制剂具有明显的药物抵抗性。 还有研究表明肿瘤上皮细胞PDGF 受体α 的表达增加可提示较高的肿瘤转移风险。

二、肝癌微环境中的免疫细胞

肝脏是一个免疫特惠器官,具有独特的免疫系统,参与机体局部和整体水平的免疫调节。 一方面,肝脏可以识别和清除体内多种病原微生物、毒素和肿瘤细胞,另一方面,肝脏的免疫防御功能又受到极其精确的调节,其局部免疫反应常常较弱并表现出免疫特惠现象。 免疫微环境的防御功能越强越能有效地控制肿瘤的进程,而处于耐受状态的免疫微环境往往会促进肿瘤的发生、发展和转移。 肝癌患者局部免疫微环境异常,导致机体对肝癌细胞的免疫防御能力减弱,是肝癌产生免疫逃逸和转移复发的重要因素之一。 此外,肝癌细胞也可以通过修饰自身表面抗原以及改变肝癌组织周围的微环境来逃避机体的免疫识别与攻击,最终导致肝癌的转移复发。因此,肝癌局部免疫微环境在肝癌转移复发中发挥了重要的作用。 肝癌局部免疫微环境由多种免疫细胞、免疫分子与肝癌细胞相互作用形成的复杂动态网络系统,本部分从自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM),探讨免疫微环境在肝癌转移复发中的作用。

(一)自然杀伤细胞

自然杀伤细胞(natural killer,NK)具有在体外溶解多种肿瘤细胞、清除移植瘤以及参与小鼠自发性肿瘤的免疫监视的作用。 在人体中,NK 细胞以表达黏附糖蛋白CD56、不表达T 细胞抗原CD3 为特征。 根据NK 细胞表面CD56 的密度可以将NK细胞分为功能明显不同的两群细胞:CD56dimCD3-细胞和CD56brightCD3-细胞。 CD56dimCD3-细胞约占循环外周血NK 细胞的90%,具有显著的细胞毒效应,高表达细胞内穿孔素。 这群细胞表达FcgR Ⅲa(CD16),一种介导抗体依赖的细胞毒作用(antibodydependent cellular cytotoxicity,ADCC)的IgG 类抗体的受体。 而CD56brightCD3-仅占外周血NK 细胞的10%,这类细胞能更有效地产生细胞因子。 NK 细胞活性受到细胞因子的调控,例如细胞因子IL-2 协同γ-干扰素可以增强NK 细胞的杀伤活性并诱导其活化与增殖。 而IL-2 和IL-12 可以通过增强NK 细胞介导的ADCC 作用,提高NK 细胞的抗HCC 免疫反应。 研究发现通过基因修饰使肝癌细胞表达IL-12或应用腺病毒载体将酪氨酸激酶-3 配体转染到肝癌细胞中可增强机体NK 细胞的抗HCC 活性。 作为人体内重要的天然免疫细胞,NK 细胞数量上的减少或者功能上的减弱都将直接影响到机体对肝癌细胞的免疫杀伤作用。 崔刘福等研究发现原发性肝癌患者的外周血NK 细胞数量下降,其非特异性肿瘤杀伤作用减弱,导致不能对肝癌细胞进行有效的杀伤。 陈罡等研究发现,肝癌中NK 细胞数量明显多于肝硬化组和正常肝组,但随着临床分期的发展有下降的趋势,且可能与肝癌患者的转移复发相关。杨秀华等研究同样发现,在肝癌组织微环境中,NK细胞的含量及活性高低与疾病的转归平行,其活性下降是肝癌患者预后不良和疾病复发的重要因素。肝癌患者NK 细胞活性降低还与AFP 升高有关。辛永宁等发现AFP 升高肝癌患者较AFP 正常者NK 细胞的活性降低。

(二)树突状细胞

树突状细胞(dendritic cells,DC)是目前已知功能最强的专职抗原呈递细胞,肝脏DC 的功能决定了肝脏局部免疫反应的走向。 肝脏DC 位于门脉管道和中央静脉周围,多数为CD1a 阴性,具有较强的抗原吞噬能力以及移行到淋巴组织的能力。 DC 具有激活初始T 细胞以及产生免疫耐受的双重功能。肝脏DC 主要是不成熟DC(immature DC,imDC),它们表达MHC 分子,但几乎不表达CD40、CD80 以及CD86 等共刺激分子。 大量研究发现肝脏局部微环境中存在多种细胞因子抑制DC 成熟和功能:肝内库普弗细胞(Kupffer cell)和肝血窦内皮细胞均能表达抗炎细胞因子IL-10 和TGF-β;在应激状态下,包括肝星形细胞在内的储脂细胞也能大量分泌TGF-β;肝星形细胞还能通过分泌IL-10 抑制骨髓系DC(myeloid derived DC)表达共刺激分子和活化同种异体T 细胞的功能;另外,在自分泌和旁分泌的TGF-β作用下肝细胞也会分泌IL-10。 有研究报道,肝脏内还存在所谓致耐受性DC(tolerogenic DC,Tol-DC),肝脏Tol-DC 可以通过自分泌IL-10 活化Treg 细胞,通过DC-Treg 抑制性反馈环下调DC 表面MHCⅡ分子和共刺激分子的表达。

肝癌的发生、发展及预后与肝脏DC 密切相关。首先,肝脏DC 的功能缺陷可促进HCC 的进展。Chen S 等研究发现,在肝癌癌旁组织中成熟DC 数量极低,而在肝癌组织中几乎没有成熟DC,导致肝癌组织无法募集足够的肿瘤特异性淋巴细胞进而产生有效的抗肿瘤作用。 临床预后分析进一步证实,肝癌结节中浸润的成熟DC 数目越多,复发转移的风险越低,若同时伴随较多的CD8+或记忆T 细胞,则复发转移的风险进一步降低。 Fujiwara K 等研究发现HCC 患者肝脏及外周非成熟DC 数量增加,且非成熟DC 数量与肿瘤分化程度呈负相关。 其次,肝癌可以加剧肝脏DC 的功能缺陷。 Um 等研究发现AFP 能下调DC 表面共刺激分子CD40 和CD86的表达,降低其同种异体T 细胞活化能力,同时增加DC 的凋亡,降低DC 分泌IL-12 和TNF-α,使HCC 逃避免疫监视。 Feijo E 等研究发现HCC 肿瘤细胞可以通过大量分泌IL-8,与其受体CXCR1和CXCR2 相互作用,使DC 局限在肿瘤组织中,限制了DC 向次级淋巴组织的迁移。 Lee WC 等研究发现,HCC 患者全身及局部IL-10 含量均明显增加,且肝癌细胞主要通过分泌IL-10 来抑制DC 的成熟和T 细胞活化功能。 翁永强等研究发现,肝癌细胞或微环境来源癌细胞裂解物,可导致由R-中心体肌动蛋白(centractin)介导的DC 表型和功能异常,也可能是肝癌免疫逃逸的机制之一。 另外,Jinushi M 等研究发现,在丙型肝炎感染时,NK会高表达CD94/NKG2A,通过与其配体HLA-E 相互作用后,使NK 分泌大量IL-10 和TGF-β,导致DC 功能缺陷。

(三)肿瘤浸润T 淋巴细胞

正常成年人肝脏具有支持组织特异的淋巴细胞的分化功能,可产生所有品系的淋巴细胞。 肝脏淋巴细胞组成具有以下特点:①B 淋巴细胞含量不超过5%;②CD4/CD8 比例约为1 ∶3.5;③存在大量非常规的淋巴细胞,84%的T 淋巴细胞表达T 细胞受体TCRαβ,且超过15%～30%的T 淋巴细胞表达TCRγδ;④大约40%的非常规淋巴细胞同时表达CD4 和CD8 或单独表达CD56 或CD8α;⑤大多数T细胞低表达CD56,处于慢性激活状态。 正常状态下,T 细胞各亚群间比例相互平衡协调,维护T 细胞发挥正常抗肿瘤免疫。

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)主要存在炎性浸润的实体肿瘤内部,它在患者体内处于机体免疫系统与肿瘤相互作用的最前沿,其组成和功能在一定程度上反映了机体抗肿瘤反应的性质和强度。 Wada Y等研究发现,相对于那些肿瘤组织几乎没有淋巴细胞浸润的肝癌患者,肿瘤组织有明显淋巴细胞浸润的肝癌患者的预后较好。 Büchler M 等发现,肝癌肿瘤浸润的CD8+T 细胞与预后密切相关,浸润的CD8+T 细胞越多,患者的复发率越低,预后越好。肝癌患者存在Th1/Th2 失衡、向Th2 偏移的现象。与正常肝组织相比,转移性肝癌组织中TNF-α、IFN-γ 和IL-1 等Th1 型细胞因子表达水平降低,而IL-4、IL-5、IL-8 和IL-10 等Th2 型细胞因子表达明显升高。 Th17 细胞是CD4+T 辅助细胞亚群的一员,主要分泌IL-17、IL-21 及IL-22 等细胞因子。 Zhang JP等研究发现IL-17 在肝癌组织中的表达明显高于非肿瘤组织,并且肿瘤组织中Th17 细胞的密度与肝癌患者的总体生存率及无病生存时间呈现负相关关系。 CD4+T 细胞还包括一群具有免疫调节功能的调节性T 细胞(regulatory T cells,Treg),能够抑制免疫反应。 Fu J 等研究发现HCC 中浸润到肿瘤细胞癌巢中的CD4+CD25+FoxP3+Treg 细胞的数目增加,而Treg 细胞的增加可以抑制细胞毒性CD8+T 细胞(CTL)的功能,且与肝癌患者的预后不良相关。 Cai L等研究发现,在HCC 的发展过程中T-reg 细胞的增加还可抑制NK 细胞的免疫应答作用。 NKT 细胞是一类具有NK 细胞和T 细胞表型特征的细胞,同时表达TCRαβ 或TCRγδ 与NK 细胞受体如CD16、CD56、CD69、CD161、KIR 受体和CD94 等。 NKT 细胞可通产生IFN-γ 和活化NK 细胞抑制肝肿瘤的生长。 然而也有研究报道CD4+NKT 细胞可以通过产生Th2 细胞因子,接着抑制肿瘤抗原特异性CD8+T细胞增殖,也可能发挥促进肿瘤生长的作用。

(四)肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage,TAM)

TAM 作为肿瘤免疫微环境中最丰富的免疫细胞,在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。 巨噬细胞来源于CD34+骨髓髓样干细胞,受各种趋化因子作用进入血液循环,短暂停留后移行到全身各组织器官,最终发育成熟为巨噬细胞。 巨噬细胞在不同器官组织命名不同,如肝脏Kuppfer 细胞、骨骼破骨细胞和神经胶质细胞等。 不同的反应环境可以使T 细胞极化成Th1 和Th2 等特殊的表型,与之相似,不同的活化环境也可以使巨噬细胞发生不同的极化:①TAM 被脂多糖(LPS)和干扰素-γ(INF-γ)等刺激物以经典方式激活时,表现为M1 型。 由于MHCⅡ、CD80、CD86 活性氧和促炎性细胞因子表达增加,M1 型TAM 的特点表现为抗原递呈能力和细胞毒性作用的增强;②当免疫系统对寄生虫和过敏原等起反应时,作为Th2 型反应的一部分,产生IL-4 和IL-13 等细胞因子,表现为M2 型活化。 M2 型TAM 的特点是甘露糖受体、清道夫受体和精氨酸酶表达增加等。 Budhu A 等研究发现,肝癌患者体内的免疫环境特点与肝癌进展密切相关,并指出肝癌患者体内巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)水平升高可预测肝癌术后转移和复发情况;Zhu 等研究发现高水平的M-CSF 和TAM 浸润的肝癌患者,其术后肿瘤肝内转移率高、生存率低。 肝癌的TAM 浸润程度还与肝癌微血管密度呈显著相关,而微血管密度又与肝癌转移和分化程度密切相关,进一步提示TAM 在介导血管生成的同时,也可影响肝癌侵袭转移和分化恶性程度。 TAM 还可以通过协同其他免疫细胞一起实施负向调控免疫作用,协助肝癌细胞逃避免疫监视,间接促进肝癌进展。 Wu 和Kuang等分别发现肝癌周围TAM 通过分泌PD-L1 抑制特异性T 细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。 Zhou 等研究报道肝癌癌周TAM 浸润程度与肝癌癌内Treg 呈正相关,并且肝癌细胞培养上清可以刺激分化成熟的TAM 分泌大量IL-10,继而调节Treg 募集在肝癌细胞的周围,从而发挥免疫负调控作用。